ПЦР расшифровывается как «полимеразная цепная реакция», в основе этого метода – выявление в исходном материале определенного участка ДНК и сравнение его с образцом, благодаря чему можно подтвердить или опровергнуть наличие инфекционного заболевания, установить личность или подтвердить отцовство. Метод был разработан Керри Мюллисом в 1983 году, спустя 10 лет компания Цетус, в которой он работал, запатентовала его и ПЦР стала использоваться в медицине и криминалистике, а также для научных целей.

Принцип метода

Для исследования берут любой биологический материал – кровь, ликвор, мокроту, синовиальную жидкость, биоптаты тканей, также возможно использовать мертвый материал. Материал содержит ДНК с искомым фрагментом гена и называется ДНК-матрицей. К ДНК-матрице добавляют  следующее компоненты:

• 2 праймера, которые ограничивают искомый фрагмент гена. Праймеры представляют собой химически синтезированные молекулы, состоящие из 18 – 30 нуклеотидов. Они комплиментарны начальному и конечному участку того фрагмента ДНК, который будет далее использован в работе;
• фермент ДНК-полимеразу, благодаря которой происходит удвоение участка ДНК;
• строительные блоки для построения фрагмента ДНК – дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, содержащие все виды азотистых оснований – аденин, гуанин, цитозин, тимин;
• йоны Mg²⁺ для работы фермента и буферный раствор, который обеспечивает необходимый уровень рН.

Все компоненты смешиваются в необходимом соотношении в пробирке и помещаются в амплификатор – аппарат для проведения ПЦР, в котором проходят все стадии процесса амплификации.

Амплификация – удвоение маркерного фрагмента ДНК (ограниченного с двух сторон праймерами). В процессе амплификации происходит:

• термическая денатурация ДНК, в процессе которой происходит раскручивание двухнитевой структуры ДНК на 2 однонитевые цепи;
• гибридизация, или отжих, праймеров – присоединение праймеров к концевым участкам искомого фрагмента, в результате чего формируется структура, узнаваемая ДНК-полимеразой;
• элонгация цепи, т.е. присоединение строительных компонентов, в результате чего образуется новая цепочка ДНК, идентичная маркерному фрагменту.

В результате такого амплификационного цикла молекула ДНК удваивается. После 30 – 40 таких циклов количество искомых участков ДНК достигает 1 млрд. Этого количества ДНК-копий становится достаточно, чтобы их идентифицировать.

Возможности ПЦР

Этот метод является высокоспецифичным и высокочувствительным. Специфичность определяется тем, что производится идентификация уникального участка гена, который характерен только для данного микроорганизма (если диагностируется инфекция) или данного индивидуума (при идентификации личности), то есть невозможно получить ложноположительный ответ. Чувствительность определяется тем, что для получения результата достаточно, чтоб в исследуемом материале находилось очень незначительное количество ДНК –  от 10 до 100 копий. Это позволяет использовать минимальные объемы проб – до нескольких микролитров, что удобно, особенно в неонаталогии, педиатрии, криминалистике.

Высокая чувствительность – плюс или минус?

Столь высокая чувствительность ПЦР-диагностики не всегда удобна для выявления инфекционного заболевания, ведь в организме может находиться небольшое количество возбудителя, что наблюдается при здоровом носительстве, а ПЦР все равно даст положительный результат. Для сравнения чувствительность обычного бактериологического метода диагностики, который повсеместно применяется в лабораториях, равна 1000 микроорганизмов в 1 мл, то есть если в материале меньшее количество возбудителя, оно просто не будет обнаружено. И это вполне удобно, так как о наличии заболевания можно говорить при обнаружении в 1 мл материала не менее 10 тыс. бактерий. А для ПЦР, как уже говорилось, достаточно от 10 до 100 бактерий, от есть, обычная ПЦР-диагностика дает сведения лишь о наличии инфекционного агента, а не о его количестве.

Для решения этой проблемы была создана новая модификация метода – ПЦР в реальном времени. В этом случае уже в процессе амплификации происходит подсчет копий ДНК, и чем больше микроорганизмов находилось изначально в исследуемом материале, тем раньше и больше возрастает количество специфических фрагментов. Таким образом, ПЦР в реальном времени позволяет произвести количественную оценку ДНК в исследуемом материале.

Недостатки метода

Помимо высокой чувствительности метод ПЦР имеет некоторые другие недостатки:

• может быть обнаружена ДНК как живого, так и мертвого микроорганизма. Из-за этого невозможно провести контроль лечения. Интерпретация результатов должна проводиться только лечащим врачом;
• при использовании разных тест-систем можно получить разные результаты исследования. Это связано с тем, что искомый фрагмент гена в результате мутаций может измениться, и праймер к нему не присоединится, будет получен ложно-отрицательный результат. Другая тест-система с праймером к другому участку гена даст положительный результат.

Сфера применения ПЦР

Полимеразная цепная реакция применяется в самых различных областях – в медицине, криминалистике, археологии, она позволяет решить множество научных и практических задач.

Сфера медицины. Этот метод используется для определения множества инфекционных заболеваний, среди которых ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, герпетическая, папиломовирусная, хламидийная, микоплазменная, хеликобактерная инфекции, туберкулез и многие другие. При помощи ПЦР стало возможным диагностировать онкологические заболевания на доклинической стадии. С этой целью выявляют  дефекты структуры протоонкогенов, что является маркером онкологического процесса в организме. ПЦР применяется в трансплантологии для определения степени сродства между организмом и трансплантатом, благодаря этому методу стало возможным максимально быстро и точно подобрать пару «донор-реципиент». А также в последнее время получило распространение использовать ПЦР для диагностики наследственных заболеваний, что возможно также в пренатальном периоде. Диагностируют такие заболевания, как муковисцидоз, финлкетонурия, болезнь Коновалова-Вильсона, гемофилия А и В и др. заболевания.

Сфера судебной медицины и криминалистики. ПЦР используется для определения отцовства, для опознания трупов (для этого достаточно обрывков тканей или пятен крови), для определения причастности к убийству, изнасилованию.

А также ПЦР-диагностика применяется для выявления генетически модифицированных организмов, для анализа древних останков, для генотипирования микроорганизмов и решения других научных задач.